PCR

  1.Obxectivo:

Analizar unhas mostras de carne para coñecer a súa orixe, e determinar se son completamente de tenreira  ou conteñen carne de porco.Para isto imos utilizar a técnica da PCR, unha reacción en cadea da polimerasa que consiste en facer numerosas copias dunha mostras a través dun termociclador ( aparato que permite realizar ciclos de temperatura, e dicir, poñer unha mostra a unha determinada temperatura durante un tempo), coa finalidade de detectar pequenas cantidades de material xenético dunha mostra (neste caso, ADN porcino ou bovino). Así, se existe a suficiente cantidade de material xenético dentro da mostra de carne , que pode ser amplificada por riba dun nivel determinado, considérase que esa mostra contén ese tipo de ADN.Ao terminar o proceso de PCR , o ADN non é visible a ollo nin ten cor propia como para tinxir a disolución. Precisamos dunha forma de facelo visible que sexa rápida, sinxela .Unha das solucións que se usa nos laboratorios de bioloxía molecular e que imos utlizar neste caso é o marcaxe do ADN cunha molécula fluorescente. Estas moléculas marcadores soamente emiten luz fluorescente se están unidas ao ADN. Se non hai ADN en cantidade suficiente, os marcadores non poden unirse ás cadeas do ADN e non emiten luz. Nós usamos o laranxa de tiazol, unha molécula pequena que non é fluorescente en auga pura, pero que emite unha luz verde-amarela intensa en canto se une ao ADN e se ilumina con luz azul.

2. Hipótese:

Unha vez coñecido o obxectico e o  procedemento, debemos esperar que no noso caso utilizando cebadores de porco (que son complementarios especificamente a secuencias do ADN de porco ) aquelas mostras que presenten carne de porcina emitirán fluorescencia, e si non emite flourescencia debemos entender que esas mostras non conteñen carne de porco.

3. Deseño do experimento, procedemento e material:

 

procedemento:

1. lavar mans, superficies e poñer guantes para evitar erros por contaminación.

2. rotular todos os tubos na tapa e no lateral e poñelos por orde. Temos catro tubos coas mostras de carne problema, un control negativo ( leva os reactivos pero non leva mostra de ADN así que sabemos que non pode producir luz ao sometelo á luz azul ) e un control positivo ( no que introducimos unha mostra de ADN PORCINO así que si está ben feito ten que emitir fluorescencia en contacto coa luz azul ).

3. Ir engadindo os reactivos nos tubos nas cantidades e orde correspondente cunha micropipeta (táboa ficha)*. Posto que imos facer seis mostras, mesturamos os reactivos para as seis e logo repartímolos aos seis tubos, para aforrar tempo e puntas.

4. Engadimos a cada tubo 1 ul da mostra de ADN correspondente, menos ao control negativo.

5. Unha vez temos todos os reactivos e mostras de ADN nos tubos de PCR,engadimos unha pinga de aceite mineral, cunha pipeta Pasteur, para evitar a evaporación da mostra.

6. Poñemos os tubos no termociclador e poñémolo a funcionar.

7. Unha vez acabados os ciclos sacamos os tubos do termociclador e métemolos no conxelador.

8. Ao día seguinte incorporamos 1ul de laranxa de tiazol a cada mostra, esperamos cinco minutos e observamos co transiluminador (emite luz azul) e interpretamos os resultados.

Material:

• Mostras de ADN da carne para a cal hai dúbidas

• Mostra de ADN porcino

• Tubos de PCR

• Pipetas: micropipeta, puntas  e pipeta Pasteur

• Termociclador

• Transiluminador

• Material de vidrio do laboratorio

• Laranxa de tiazol

• Aceite mineral 

• REACTIVOS:

• Mili Q (auga ultra pura)

• Tampón

• Cloruro de magnesio

• Nucleótidos

• Cebadores complementarios a unha secuencia específica do xenoma do porco

•  Taq polimerase

4. RESULTADOS:

( foto coas interpretacións dos resultados nas catro mostras problema e nos controis ).Acabamos obtendo control negativo e positivo non fluorescente e fluorescente respectivamente tal como esperamos e ademais dúas mostras problemas fluorescentes ( presenza carne porcina ) e outras dúas non fluorescente(ausencia).

Fotos dos resultados:

* táboa dos reactivos(para coñecer cantidades e orde)