PCR

  1.Obxectivo:

Analizar unhas mostras de carne para coñecer a súa orixe, e determinar se son completamente de tenreira  ou conteñen carne de porco.Para isto imos utilizar a técnica da PCR, unha reacción en cadea da polimerasa que consiste en facer numerosas copias dunha mostras a través dun termociclador ( aparato que permite realizar ciclos de temperatura, e dicir, poñer unha mostra a unha determinada temperatura durante un tempo), coa finalidade de detectar pequenas cantidades de material xenético dunha mostra (neste caso, ADN porcino ou bovino). Así, se existe a suficiente cantidade de material xenético dentro da mostra de carne , que pode ser amplificada por riba dun nivel determinado, considérase que esa mostra contén ese tipo de ADN.Ao terminar o proceso de PCR , o ADN non é visible a ollo nin ten cor propia como para tinxir a disolución. Precisamos dunha forma de facelo visible que sexa rápida, sinxela .Unha das solucións que se usa nos laboratorios de bioloxía molecular e que imos utlizar neste caso é o marcaxe do ADN cunha molécula fluorescente. Estas moléculas marcadores soamente emiten luz fluorescente se están unidas ao ADN. Se non hai ADN en cantidade suficiente, os marcadores non poden unirse ás cadeas do ADN e non emiten luz. Nós usamos o laranxa de tiazol, unha molécula pequena que non é fluorescente en auga pura, pero que emite unha luz verde-amarela intensa en canto se une ao ADN e se ilumina con luz azul.

2. Hipótese:

Unha vez coñecido o obxectico e o  procedemento, debemos esperar que no noso caso utilizando cebadores de porco (que son complementarios especificamente a secuencias do ADN de porco ) aquelas mostras que presenten carne de porcina emitirán fluorescencia, e si non emite flourescencia debemos entender que esas mostras non conteñen carne de porco.

3. Deseño do experimento, procedemento e material:

 

procedemento:

1. lavar mans, superficies e poñer guantes para evitar erros por contaminación.

2. rotular todos os tubos na tapa e no lateral e poñelos por orde. Temos catro tubos coas mostras de carne problema, un control negativo ( leva os reactivos pero non leva mostra de ADN así que sabemos que non pode producir luz ao sometelo á luz azul ) e un control positivo ( no que introducimos unha mostra de ADN PORCINO así que si está ben feito ten que emitir fluorescencia en contacto coa luz azul ).

3. Ir engadindo os reactivos nos tubos nas cantidades e orde correspondente cunha micropipeta (táboa ficha)*. Posto que imos facer seis mostras, mesturamos os reactivos para as seis e logo repartímolos aos seis tubos, para aforrar tempo e puntas.

4. Engadimos a cada tubo 1 ul da mostra de ADN correspondente, menos ao control negativo.

5. Unha vez temos todos os reactivos e mostras de ADN nos tubos de PCR,engadimos unha pinga de aceite mineral, cunha pipeta Pasteur, para evitar a evaporación da mostra.

6. Poñemos os tubos no termociclador e poñémolo a funcionar.

7. Unha vez acabados os ciclos sacamos os tubos do termociclador e métemolos no conxelador.

8. Ao día seguinte incorporamos 1ul de laranxa de tiazol a cada mostra, esperamos cinco minutos e observamos co transiluminador (emite luz azul) e interpretamos os resultados.

Material:

• Mostras de ADN da carne para a cal hai dúbidas

• Mostra de ADN porcino

• Tubos de PCR

• Pipetas: micropipeta, puntas  e pipeta Pasteur

• Termociclador

• Transiluminador

• Material de vidrio do laboratorio

• Laranxa de tiazol

• Aceite mineral 

• REACTIVOS:

• Mili Q (auga ultra pura)

• Tampón

• Cloruro de magnesio

• Nucleótidos

• Cebadores complementarios a unha secuencia específica do xenoma do porco

•  Taq polimerase

4. RESULTADOS:

( foto coas interpretacións dos resultados nas catro mostras problema e nos controis ).Acabamos obtendo control negativo e positivo non fluorescente e fluorescente respectivamente tal como esperamos e ademais dúas mostras problemas fluorescentes ( presenza carne porcina ) e outras dúas non fluorescente(ausencia).

Fotos dos resultados:

* táboa dos reactivos(para coñecer cantidades e orde)

 

 

 

Necropsia sardiña e frotis sanguíneo

 NECROPSIA

A necropsia é o examen completo, ordeado e sistemático do cadáver nun animal co fin de determinar cambios morfolóxicos en órganos e tecidos que nos permitan coñecer a causa da morte ou enfermidade,no meu caso unha necropsia dunha sardiña,

-

Procedemento

Preparamos todo o material necesario para realizar esta proba, poñemos guantes e colocamos o peixe sobre o lado dereito. Inspecionamos externamente o peixe e tomamos unha mostra de escamas,aletas, ollo e branquias, levantando o opérculo previamente. Pasamos ao exame interno, para isto realizamos unha incisión pola liña media desde o ano ata a boca e levantamos levemente a parede abdominal para inspeccionar as vísceras da sardiña, observamos a cavidade abdominal,pericárdica e cranial. Extraemos as vísceras e no meu caso conseguín ril, fígado,encéfalo, corazón, lengua e bazo. Finalmente recollemos e lavamos todo o material e superficies nas que traballamos e tomamos fotos das mostras.

Material:

• Tixeiras

• Pinzas

• Bisturí

• Guantes

Fotos:

1.Branquias 2. Ovarios 3. Dixestivo 4. Ollo 5. Corazón 6. Escamas 7. Aletas 8. Encéfalo 9. Lengua 10. Dixestivo

Técnicas de diagnóstico rápido: Frotis sanguíneo.

Nos nosos peixes foi posible extraer sangue da vea caudal.Para extraela cravamos a agulla  (nós utilizamos unha de 5ml) uns milímetros por debaixo da liña lateral, dirixíndoa cara arriba cun ángulo aproximado de 45º. Ao conseguir sangue decidimos facer un frotis sanguíneo que se fai da seguiente maneira. Colocamos unha gota da sangue de sardiña no extremo dun portaobxectos e apoiamos outro portaobxectos co que imos estender inclinado por diante da gota. De seguido movémolo amodo cara atrás ata que toque a gota e facemos un movemento rápido e continuo cara adiante para extendelo debidamente.

Agora debemos tinguir a mostra, para isto imos utilizar un dos kits de tinguidura rápida así que deixamos secar a mostra ao aire e somerxémola cinco veces en cada un dos tres líquidos do kit. Primeiro o líquido azul claro- panóptico rápido 1, despois no rosa-panóptico rápido 2- e finalamente o último a tinguidura azul escura- panóptico rápido 3-. Pòr último aclaramos con auga da bila e cando estea seca podmeos observala ao microscopio e tratar de identificar células sanguíneas.Fixemos o mesmo procedemento con sangue de can e sangue de gato proporcionado pola profesora.

 

Mostras sen tinguir                                  mostras tinguidas

.

Análise da mostra no microscopio:

Sangue de sardiña

150x aumentos

Sangue de gato

60x aumentos

 

Caso 6 (Pepa)

 1.Descripción do caso :

Porca de tres meses dunha explotación porcina, na cal houbo un aumento da mortalidade nos ranchos pequenos. Este suceso concidiu con obras na granxa, e a gandeira sospeita dun obreiro que roldaba moito esas porqueiras. Os síntomas que presentaba Pepa e os outros porcos son:

• Tose

• diarrea con feces escuras

• crecemento deficiente

• palidez de mucosa oral

• mordeduras nos rabos e orellas

• líquido turbio,amarelado nas cavidades torácica e abdominal

• lesións pulmonares(vermello,nódulos con pus, adheridos á cavidade torácica)

• aumento do tamaño dos linfonodos do mediastino

• úlcera no estómago

• hemorraxia no lumen do estómago e intestino

Análise da mostra  

Grazas ao atlas de histoloxía proporcionado pola profesora sabemos que a mostra  trátase dun pulmón.Vemos un gran cambio polo que atopamos unha parte de pulmón san e outra de pulmón afectado.A mostra está tinguida  con H&E (hematoxicilina-eosina), esta é unha das tinturas máis utilizadas en histoloxía. A hematoxicilina é un colorante básico e a eosina é un ácido. Desta maneira podemos apreciar de diferente cor as estruturas das células.

Aumentos:

150x                                      60x                                                150x

Podemos observar diferenzas notables, como son, por unha parte, a diminución da cantidade e do tamaño dos alvéolos. Ademais, os bronquíolos conteñen sangue, cando en estado san esto non ocorre. Estes porcos teñen menos superficie alveolar e dificúltaselles o intercambio de gases entre alvéolo e sangue.

Hipótese 1.

Contando coas sospeitas da gandeira a primeira posiblidade é unha intoxicación debido a que alguén lles proporcionara algunha sustancia tóxica ou incluso debido ao utlizado para realizar as obras da granxa. Entre as primeiras está a intoxicación por fumonisina producida por colleitas de maíz afectadas ou pienso que provoca moitos dos síntomas que presenta Pepa, entre eles edema pulmonar o que produciría esa acumulación de líquido na cavidade torácica. Entre as segundas atópase a intoxicación por hidrocarburos clorados. Os produtos derivados de petróleo, produtos de limpeza e pegamentos conteñen estes  hidrocarburos (substancias compostas na súa maior parte por hidróxeno e carbono) que debido as obras e á limpeza podería producir a morte destes ranchos ainda que esto non explicaría porque solo afecta aos ranchos pequenos ou algúns dos síntomas.

Hipótese 2. 

 Ahora centrámonos en enfermidades do aparello respiratorio e dixestivo polo que outra opción é unha enfermidade como a pleuropulmonía   contaxiosa porcina,unha enfermidade respiratoria moi contaxiosa que produce altas taxas de mortalidade, produce síntomas como dificultade respiratoria,sangrado, anorexia, descarga nasal que encaixan co cadro clínico de Pepa e que ademais contraese con máis facilidade se o animal está baixo estrés( producido polas obras) o que tamén producirías as mordeduras nos rabos e nas orellas..

Hipótese 3.

Outra opción é a gripe porcina. A gripe (ou influenza) porcina é unha infección vírica altamente contaxiosa dos porcos. Está causada polo virus de influenza tipo A, da familia 

Orthomyxoviridae. Os síntomas que provoca esta enfermidade son:  febre,respiración abdominal, letargia, anorexia, pérdida de peso, diarrea, descarga nasal, tos seca e dificultade na respiración, síntomas que presentaba Pepa, ademais a nivel de tecidos os animais  que padecen esta enfermidade presentaban  partes afectadas dos pulmones consolidadas, de cor vermello escuro a vermello púrpura, vías aéreas a menudo dilatadas e cheas de líquido, e 

aumento de tamaño de nódulos linfáticos traqueobronquiais e mediastínicos, a maioria destas lesións foron comentadas na descripción do caso e no análise da mostra.

Conclusión:

Debido a semellanza dos síntomas e lesións a nivel pulmonar atopadas en Pepa o máis probable e que se trate da gripe porcina. O resto dos síntomas que presentaba tamén teñen explicación, investigando descubrín que hai unha relación entre os brotes de neumonía (especialmente a gripe) e a incidencia de úlceras gástricas, as mordeduras nos rabos e orellas como xa comentei poden estar relacionadas coa situación de estrés debido á ampliación da granxa e ao ser unha enfermidade moi contaxiosa afectou a todos os ranchos pequenos que se atopaban nesas porqueiras.

 

 

Fontes de información:

Intoxicación (envenenamiento) por hidrocarburos - Traumatismos y envenenamientos - Manual MSD versión para público general (msdmanuals.com)

Intoxicación por fumonisina - Guía de enfermedades porcinas - 3tres3, la página del Cerdo

Pleuroneumonía porcina. Un enemigo fácil de derrotar? - Engormix

Úlceras gástricas - Guía de enfermedades porcinas - 3tres3, la página del Cerdo

Microsoft Word - GRIPE PORCINA.rtf (cresa.es)